Pruebas bioquímicas para la identificación de Salmonella

 

Salmonella 

Para la identificación bioquímica de Salmonella se seleccionan al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, las cuales se deben encontrar bien aisladas. La técnica es mediante el tacto leve en el centro de cada colonia con un asa estéril, posteriormente se inocula en cada una de las pruebas bioquímicas seleccionadas. Después de la siembra en cada uno de los medios se incuban las pruebas durante 24 horas a 37 °C (Parra y cols., 2002). 

Figura 1. Selección de colonias aisladas presuntivamente Salmonella

Una de las formas rápidas de identificación de Salmonella es mediante el IMVIC: -+-+ (Brooks et al., 2010). 

Prueba de oxidasa

Mediante esta prueba se evidencia la presencia del complejo multi-enzimático denominado citocromo c oxidasa, el cual induce a la transformación del citocromo reducido a oxidado ya que capta el oxígeno, actuando como aceptor de electrones en la cadena respiratoria. 

En esta prueba se utilizan colorantes como parafenilendiamina e indofenol los cuales actúan como sustratos receptores y donadores de electrones artificiales. Parafenilendiamina es oxidado por el sistema citocromo c oxidasa, si se reduce no se presenta coloración mientras que si se oxida se colorea azul-purpura y evidencia la presencia de citocromo oxidasa c. 

Si la sustancia aceptora de electrones en la cadena respiratoria es diferente al oxigeno no hay un viraje de color en el indicador de la prueba, es el caso de los microorganismos anaerobios. 

Ser oxidasa negativos es característico de la familia Enterobacteriaceae (Prescott et al., 2004).

Agar triple azúcar hierro (TSI)

En el fondo se observa el cambio de viraje del medio debido a la fermentación de la glucosa, en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa además la coloración negra a lo largo de la punción debido a que las especies de Salmonella producen ácido sulfhídrico (H2S).

Figura 2. Se observa la fermentación de la glucosa y la producción de H2S de algunas especies de Salmonella.  

(Prescott et al., 2004).

Agar hierro lisina (LIA)

Se observa la intensificación del color purpura en todo el tubo por la descarboxilación de la lisina. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfhídrico en este medio con un color negro a lo largo de la punción. Se consideran negativos aquellos cultivos que produzcan un color amarillo en el fondo del agar. 

Figura 3. Descarboxilación y desaminación de la lisina, el tubo 3 de izquierda a derecha es característico para Salmonella. 

(Ochoa & Rodríguez, 2005).

Motilidad indol ornitina (MIO)

En esta prueba se deben interpretar los cambios conforme a lo siguiente: 

-Movilidad: evalúa la capacidad de un microorganismo para moverse por sí mismo en el medio mediante flagelos (Madigan et al., 2015). 

• Movilidad positiva: se observa el crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.
• Movilidad negativa: se observa el crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente. 

Salmonella es movilidad positiva (Prescott et al., 2004).

Figura 4. En la parte izquierda se observa un organismo con movilidad positiva, mientras que en el lado derecho se observa una prueba de movilidad negativa. 

-Indol: prueba bioquímica realizada a las bacterias para evaluar la capacidad de producir indol a partir de triptófano en presencia de un grupo de enzimas llamadas triptofanasas.

• Indol positivo: desarrollo de un anillo de color rojo después de haber agregado 3 a 5 gotas del reactivo de Kovac. 
• Indol negativo: Sin cambio de color al agregar reactivo de Kovac. 

El reactivo de Kovac es un reactivo que se utiliza para la detección de indol, el cual se forma por degradación metabólica del aminoácido triptófano mediante la enzima triptofanasa, es importante para identificar a las enterobacterias. 

Salmonella es indol negativo (Prescott et al., 2004).

Figura 5. Prueba de indol. En el tubo A se observa una reacción positiva de indol mientras que en el tubo B se observa una reacción negativa al indol por la ausencia de triptófano. 

-Ornitina: esta prueba evalúa la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (ornitina) para formar una amina, la cual genera una alcalinidad en el medio. 

• Prueba positiva: se observa intensificación del color purpura en todo el tubo por la descarboxilación de la ornitina. 
• Prueba negativa: se observa un color amarillo claro en todo el tubo. 

Salmonella es ornitina negativo. 

Figura 6. Descarboxilación de la ornitina. Se observa la descarboxilación de la ornitina en el medio en el tubo totalmente morado. 

Pruebas confirmatorias 

SIM

El medio SIM se utiliza como recurso para identificar a los miembros de la familia Enterobacteriaceae. Está compuesto por tripteína, peptonas, sulfato de hierro, sulfato de amonio, tiosulfato de sodio y agar. La letra S del acrónimo SIM hace referencia a la producción de ácido sulfhídrico que generan las bacterias, la I corresponde a indol y la M del acrónimo es de motilidad. 

En este medio es posible ver la producción de sulfuro de hidrogeno (H2S), la formación negativa del indol y la motilidad positiva que producen las especies de Salmonella. La formación de ácido sulfhídrico es debida a que las bacterias toman el azufre de tiosulfato de sodio presente en el medio, este gas reacciona con la sal de hierro presente en el medio que permite la formación de sulfuro ferroso precipitando a color negro (Ochoa & Rodríguez, 2005). 

RM-Voges Proskauer 

Rojo de metilo: esta prueba se utiliza para evaluar la capacidad de un organismo para producir y mantener estables los productos finales ácidos de la fermentación de la glucosa

• Rojo de metilo positivo: se observa un anillo de color rojo en la superficie del caldo, debido a la generación de productos finales ácidos como la formación de ácido láctico, ácido fórmico, ácido succínico y ácido acético. 
• Rojo de metilo negativo: no hay cambio de coloración en el medio, los organismos rojo de metilo negativos metabolizan los productos de la fermentación inicial por descarboxilación para producir acetoína, lo cual da como resultado una disminución de la acidez en el medio y eleva el pH a la neutralidad. 

Salmonella es rojo de metilo positivo. 

Figura 7. Salmonella es rojo de metilo positivo, esto hará que el medio se torne de color rojo por la acidez del medio. 

Voges Proskauer: se utiliza para determinar la capacidad de los organismos para producir productos finales neutros como lo es el 2,3-butanodiol o acetoína a partir de la fermentación de la glucosa. 

• Voges Proskauer positivo: se forma un color rosa-rojo en la superficie del tubo.
• Voges Proskauer negativo: no se forma la coloración rosa-roja, el tubo permanece con una coloración amarilla. 

Los miembros de las Enterobacteriaceae pueden convertir la glucosa en piruvato mediante la vía Embden-Meyerhof (Brooks et al., 2010). 

    Figura 8. Prueba Voges Proskauer. En la imagen se observa a la izquierda una prueba positiva y a la derecha una prueba negativa. 

Salmonella es VP negativo, debido a que utiliza la metabolización de la glucosa generando piruvato por la vía del ácido mixto, por lo que produce ácidos como el ácido láctico y el ácido acético que mantienen un ambiente acido. Este organismo produce una gran cantidad de ácidos orgánicos que incluyen ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico y ácido succínico por lo que el medio permanece de color rojo después de añadir rojo de metilo el cual es un indicador de pH (Brooks et al., 2010).

Urea

La prueba de urea detecta la fermentación de la urea con la producción de amoniaco la cual es posible mediante la enzima ureasa que a su vez genera dos moléculas de amoniaco y dióxido de carbono. 

• Urea positiva: el medio se torna de color rosa
• Urea negativa: el medio se torna color amarillo

Salmonella es urea negativa (Madigan et al., 2015).

Figura 8. Prueba de la urea. la prueba bioquímica de la urea pone en prueba la capacidad de los organismos para producir amoniaco y CO2 mediante la enzima ureasa. 

Citrato de Simmons 

Esta prueba permite la identificación de las diferentes especies de la familia Enterobacteriaceae, los organismos que utilizan el citrato son capaces de fermentarlo en presencia de la enzima citrasa. 

• Citrato positivo: crecimiento del microorganismo, el medio cambia de color verde a azul debido a una alcalinización en el medio. 
• Citrato negativo: el medio permanece de color verde. 

(Brooks et al., 2010)

Figura 10. Prueba de citrato. Se observa en la imagen una prueba positiva a citrato mientras que a la derecha se observa una prueba negativa la cual indica que el organismo no utiliza el citrato como fuente de energía. 

Salmonella es citrato positivo (Prescott et al., 2004).

REFERENCIAS 

-Brooks, G.F., Butel, J.S., Ornstein, L.N., Jawtez, E., Melnick, J.L., & Adelberg, E.A. (2010). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. (25a ed). McGraw-Hill Lange. México. pp 518-519. 

-Madigan, M. T., Martinko, J. M., Bender, K. S., Buckley, D. H., & Stahl, D. A. (2015). Brock. Biología de los microorganismos (14ª edición en español), Pearson Educación, S. A. Recuperado el 16 de agosto de 2021, de https://booksmedicos.org/. (pp. 85, 92 y 101).

-Ochoa, I. M. F., & Rodríguez, A. V. (2005). Mecanismos moleculares de patogenicidad de Salmonella sp. Revista latinoamericana de microbiología, 47(1-2), 25-42.

-Parra, M., Máttar, S., & Durango, J. (2002). Microbiología, patogénesis, epidemiología, clínica y diagnóstico de las infecciones producidas por Salmonella. Revista MVZ Córdoba, 7(2), 187-200.

-Prescott, L.M, Harley, J.P & Klein, G.A. (2004). Microbiología. (5a ed). Madrid, España: McGraw-Hill. pp. 901-902.